Western Blot蛋白免疫印跡(WB)快速實驗攻略

WB即Western Blot，蛋白質免疫印跡。是一種基于抗原抗體的特異性結合，半定量檢測樣品中某種蛋白的技術。作為分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種經典實驗方法，WB雖看似??簡單，卻常因各種因素做不出好看的結果圖，甚至拿不到結果。今天帶領大家從頭開始，一整個過一遍超詳細的實驗流程，保管你一學就會，結果圖好看的讓人敬佩！

完整的WB流程，如下圖所示，包含樣本制備、SDS-PAGE、轉膜、抗體結合、蛋白檢測5個大步驟。

樣品制備

01蛋白提取（以RIPA裂解液為例）

1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入PMSF（Cat# NBS0101），使PMSF的最終濃度為1 mM。

2）貼壁細胞：去除培養液，用PBS（Cat# NBS3021）、生理鹽水或無血清培養液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。細胞充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。

• 懸浮細胞：離心收集細胞，用手指把細胞用力彈散。按照6孔板每孔細胞加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必須分裝成0.5-1×106個細胞/管，然后再裂解。

• 組織樣本：按照每20mg組織加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。??

3）充分裂解后，10000-14000 g離心3-5 min，取上清，即可進行后續的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。

【注】：RIPA裂解液的裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理，或者在裂解液中加入全能核酸酶（Cat#NBS5216）打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。

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02蛋白定量

1）配制BSA標準品體系

標準品稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進行稀釋，配置成梯度濃度的標準品。或者您可以選購BCA蛋白濃度測定試劑盒（Cat# BK0001）直接使用。

 2）取25 μL標準品或待測樣品加入到微孔板中。

3）每孔加入200 μL BCA工作液，振蕩30 s充分混勻。蓋上微孔板，37℃孵育30 min。

4）冷卻到室溫，在酶標儀上的540-595 nm波長范圍處檢測吸光度，其中562 nm波長為最佳。

5）根據BSA標準品的吸光度（減去標準品中空白孔的OD值即最終的讀數），繪制標準曲線（X-蛋白濃度ug/mL；Y-最終的OD562 nm）。依據標準曲線和樣品的稀釋倍數計算樣品蛋白濃度。

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SDS-PAGE電泳

電泳凝膠可選擇SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、PAGE凝膠快速制備試劑盒、預制膠（Bis-Tris體系）三種。

以預制膠操作為例：

1）剪開包裝取出預制膠，撕去膠板底端深綠色膠帶，緩慢地拔出梳子，將預制膠固定在電泳槽中，內槽加滿電泳緩沖液，外槽液體加入量要高于電泳槽高度1/3。可用移液槍或其他工具吸取電泳緩沖液輕輕吹打加樣孔，去除加樣孔內殘留的儲存緩沖液和雜質。

2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液（Cat# NBS1047）。水浴溶解后立即室溫存放。

3）按照每4 μL蛋白樣品加入1 μL 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。

4）100℃或沸水浴加熱 3-5 min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。

5）在每個樣品孔中上樣10-30 μg蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，推薦150 V，跑50-70 min，通常電泳至藍色染料到達膠的底端處附近即可停止電泳。

6）電泳結束，取出凝膠，使用起膠器或其他合適的工具插入到膠板兩側之間的空隙中，慢慢的上下撬動上、中、下三個不同的位置，然后在另一側重復操作，直至膠板兩側完全打開。

7）膠板打開后，凝膠可能粘在膠板的任意一側，將有凝膠一側的膠板傾斜至水中，輕輕撥動凝膠，使凝膠自由掉落到裝有水的器皿中，晃動清洗凝膠，然后取出進行后續轉膜實驗。

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轉膜與封閉

1）將膠浸于預冷的轉膜緩沖液中平衡5 min。（如果檢測小分子蛋白質，可省略該步驟，因小分子蛋白容易擴散）。

2）依據膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預冷的轉膜緩沖液中平衡10 min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2 min，再孵育于預冷的轉膜緩沖液中。（膜的選擇：0.45 μm孔徑，用于一般蛋白；0.22 μm孔徑，用于分子量小于20 kD蛋白）

3）裝配轉移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用滾輪或試管趕盡氣泡。

4）將轉移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入Fast Transfer Buffer(20X) 快速轉印緩沖液（20X）（Cat# BR0003-01）中350 mA， 40 min完成轉膜。

5）轉膜結束后，切斷電源，取出膜。

6）將膜浸沒在5 mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10 min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。注：如果沒有出現染色條帶，則表示轉膜失敗，可能需要重新轉膜或重新上樣電泳。

7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當溶液沖洗至背景清??晰后???拍照，大概沖洗2~3次，每次5 min。???

8）脫色：將膜放到0.1M NaOH溶液漂洗5 min；倒去洗脫液，再重復一次。

9）清洗：再用TBST（Cat# NBS7510）清洗膜2~3次，每次5 min。

10）將膜置于10~20 mL快速無蛋白封閉液（Cat# BR0051-01）中，在室溫振蕩孵育30 min完成封閉。 

11）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min。

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抗體孵育

1）將膜和一抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10 mL一抗稀釋緩沖液中在4oC下孵育過夜并不時輕輕晃動。

2）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min以去除殘留的一抗。

3）將膜和二抗（按照產品應用推薦稀釋度）置于10 mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。

4）用5 mL TBST（Cat# NBS7510）洗滌三次，每次15 min。

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蛋白檢測

1）最后一次洗膜的同時，按照ECL試劑盒說明書，新鮮配制發光工作液。

2）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發光工作液（125 μL發光工作液/cm²膜）中，與發光工作液充分接觸。室溫孵育3 min，準備立即壓片曝光。

3）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發光工作液。但勿洗去發光液。

4）在X光膠片暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內，蛋白帶面向上。

5）暗房內壓X光膠片，分別曝光不同的時間，如數秒到數分鐘。顯影沖洗。（從剛開始的10 s曝光時間中可以看出適當的曝光時間。由于檢測反應的動力學特征，在孵育后信號立即變得最強，但在隨后的2小時內會減弱）

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