活體成像研究底物之：

Firefly D-Luciferin D-蟲熒光素（Luc基因）

（活體成像研究/體外生物發光研究/轉錄水平研究）

基本描述：

D-熒光素（D-Luciferin）是熒光素酶（Luciferase）的常用底物，普遍用于整個生物技術領域，特別是體內活體成像技術。作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下，D-熒光素（底物）被氧化發光。當熒光素過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性（見下圖）。將攜帶熒光素酶編碼基因（Luc）的質粒轉染進入細胞后，導入研究動物如大小鼠體內，之后注入熒光素，通過生物發光成像技術（BLI）來檢測光強度變化，從而實時監測疾病發展狀態或藥物的治療功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響，根據生物發光強度的變化來指示能量或生命體征。

基本應用：

1）體內活體成像In vivo imaging；熒光素酶標記的腫瘤細胞、干細胞或傳染疾病通常注射入研究動物模型比如大小鼠內進行研究，從而對動物模型進行實時和非侵略性的監測疾病進程和/或藥效。

2）體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。

常見商業化類型的差異（熒光素鉀，鈉，游離酸）：

目前市場上常見的有三種產品形式，D-熒光素（游離酸），D-熒光素（鈉鹽），和D-熒光素（鉀鹽）。這三種產品主要差別在于溶解特性。

1）D-熒光素（游離酸）在水以及緩沖體系內的溶解性都很弱，除非溶于弱堿如NaOH和KOH溶液。溶于甲醇（10 mg/ml）和DMSO（50 mg/ml）。

2）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）能夠非常容易且快速的溶入水或者緩沖液中，使用方便，溶劑無毒性，特別適合體內實驗。配成溶液后的三種產品，在絕大多數應用上都沒有實質性的差別。

3）D-熒光素（鈉鹽）和D-熒光素（鉀鹽）基本上沒有差別，主要是使用習慣等因素影響。整體來看，鉀鹽的應用文獻明顯多于鈉鹽。

使用方法【體內成像/腹腔注射】

一．  儲存液制備（Luciferin preparation）

1.1  將D-熒光素鉀鹽（或D-熒光素鈉鹽）凍干粉回至室溫，溶于DPBS（無鈣/鎂）使其終濃度為15mg/ml。

1.2  用0.22μm濾膜過濾除菌，條件許可現配現用。若單次實在用不完，則分裝后置于≤-20℃保存，避免反復凍融。一旦使用，放到4℃解凍，保持冰冷且避光。

二．動力學曲線建立（Kinetic curve）

由于D-熒光素進入體內的生物分布非常快速且動力學具組織依賴性，因此，研究人員需正式實驗前確定自身動物在D-熒光素注射后的成像采集最佳時間。通過建立動物模型的熒光素酶動力學曲線來完成。

D-熒光素給藥的方式有腹腔注射（ip）、靜脈注射（iv）或皮下注射（sc），通常給藥方式為腹腔和靜脈。以下以腹腔注射為例。

2.1 如下腹腔注射（i.p.）D-熒光素。如果給藥前需麻醉小鼠，需要注意此步操作可能稍微延長動力學（熒光素酶峰值表達時間）。

2.2 a）如果在動物保持清醒時給藥，等待三分鐘，之后按照所選方法麻醉動物（氣化或注射麻醉）。b）將麻醉后動物置于成像室內，給藥后約5min開始第一次拍照。

2.3 對于腹腔注射模型，每5-10min（最長達40-60min）拍一次照以建立熒光素酶表達的動力學曲線。【大多數注射麻醉藥持續20-30min，要完成一次完整的動力學研究可能需要再給一次麻醉藥物。使用2%異氟烷氣體麻醉健康動物能在活體成像系統如IVIS內安全放置45min。】

2.4 根據模型建立的動力學曲線選擇最佳時間點采集圖像。【許多模型研究表明腹腔或皮下注射后約10-20min達到信號峰值，靜脈注射后約2-5min達到信號峰值。】

三．腹腔注射（i.p.）技術要點

應用示例【生物化學發光體內成像】：

Fig. 1 Image illustrates the IVIS spectrum imager and a mouse placed inside the camera box.

Fig. 2 Bioluminescence in vivo imaging. A. Representative luciferase time course (every 2 min) imaging of mice bearing subcutaneous tumors injected with luciferin. B. Graph illustrates the bioluminescence saturation of the whole mouse (displayed in A.) obtained

附錄I 各種給藥途徑和模型動物的建議位點、針頭大小和注射體積

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