活體成像研究底物之：

Coelenterazine 腔腸素（Rluc/Gluc報(bào)告基因）

— —活體成像研究/體外生物發(fā)光研究

基本描述：

腔腸素（Coelenterazine）是在水生生物中發(fā)現(xiàn)的一種發(fā)光基團(tuán)（luminophore），是許多熒光素酶的作用底物，包括海腎熒光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜錨定熒光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和藪枝蟲熒光素酶（Obelia luciferase），和發(fā)光蛋白包括水母發(fā)光蛋白（Aequorin）的構(gòu)成之一。前者的作用原理是以腔腸素為底物的熒光素酶，在含分子氧的條件下，氧化腔腸素產(chǎn)生高能量的中間產(chǎn)物，在此過程發(fā)射藍(lán)色光，光波長在450~480nm。不同于甲蟲（或螢火蟲）熒光素/熒光素酶（FLuc）系統(tǒng)不同，在含分子氧的條件下，還需要ATP和Mg²⁺的存在才能同時(shí)發(fā)光，光波長在550-570nm。由于生物發(fā)光信號(hào)和底物的差異，RLuc常常與FLuc聯(lián)合用于多報(bào)告基因研究。后者的作用原理是由脫輔基水母發(fā)光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的復(fù)合物形成活化的水母發(fā)光蛋白（Aequorin），一旦與鈣離子結(jié)合后，復(fù)合物結(jié)構(gòu)被破壞，腔腸素被氧化生成高能產(chǎn)物（Coelenteramide），同時(shí)釋放出CO₂和藍(lán)色光。

腔腸素應(yīng)用甚是廣泛，包括：1）活細(xì)胞或組織的鈣離子檢測(cè)；2）細(xì)胞或組織的超氧化物和過氧亞硝基陰離子（活性氧，ROS）化學(xué)發(fā)光檢測(cè)；3）基因報(bào)告基因檢測(cè)；4）動(dòng)物活體檢測(cè)；5）ELISA和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）藥物高通量篩選（HTS）。

腔腸素的幾個(gè)重要應(yīng)用：

A、腔腸素/水母蛋白復(fù)合物用于鈣離子檢測(cè)（Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement）

A1、與傳統(tǒng)熒光法鈣離子濃度檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

傳統(tǒng)熒光法鈣離子檢測(cè)工具琳瑯滿目，由紫外光激發(fā)到可見光激發(fā)的鈣離子檢測(cè)，比如，Fura-2激發(fā)光比率型熒光探針，Fluo-8最亮的鈣離子熒光探針，鈣離子檢測(cè)的靈敏度越來越高，也越來越方便，對(duì)儀器的要求也越來越低，那么腔腸素/水母蛋白系統(tǒng)對(duì)鈣離子檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在哪呢？

● 鈣離子/水母蛋白復(fù)合物（Ca²⁺/aequorin complex）能檢測(cè)寬廣范圍的鈣離子濃度，從~0.1μM到＞100μM。

● 比熒光法探針的背景低，樣本本身不會(huì)發(fā)生自熒光。

● 雖然信號(hào)比熒光法低，但用成像儀能得到更高的信噪比。

● 水母蛋白復(fù)合物（aequorin complex）不會(huì)從細(xì)胞內(nèi)泄露出來，因此能監(jiān)測(cè)幾小時(shí)至數(shù)天內(nèi)細(xì)胞鈣離子（Ca²⁺）濃度變化。

A2、工作原理

由脫輔基水母發(fā)光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔腸素組成的復(fù)合物形成活化的水母發(fā)光蛋白（Aequorin），一旦與鈣離子結(jié)合后，復(fù)合物結(jié)構(gòu)被破壞，腔腸素被氧化生成高能產(chǎn)物（Coelenteramide），同時(shí)釋放出CO₂和藍(lán)色光（~466nm）。

圖1. 腔腸素/水母蛋白復(fù)合物用于鈣離子檢測(cè)的反應(yīng)流程。

B、生物共振能量轉(zhuǎn)移（BRET for assaying protein-protein interactions）

B1、工作原理

BRET是一種高級(jí)的、無破壞性和以細(xì)胞為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，極其適合蛋白組學(xué)研究，包括受體研究和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的路線圖。該技術(shù)是基于含生物發(fā)光熒光素酶和GFP變體融合蛋白之間的非放射性能量轉(zhuǎn)移。

大部分應(yīng)用中融合供體是海腎熒光素酶（RLuc），而不是水母發(fā)光蛋白（Aequorin），目的是為了避免對(duì)水母來源GFP突變蛋白的內(nèi)源性親和性。受體是黃色熒光蛋白（YFP），能夠提高良種發(fā)射光間的光譜區(qū)分。當(dāng)供體和受體靠近，對(duì)腔腸素衍生物底物催化降解后產(chǎn)生的能量從熒光素酶轉(zhuǎn)移到YFP，從而使其釋放自身的熒光。BRET比值的計(jì)算顯示體內(nèi)是否存在蛋白-蛋白相互作用，這種檢測(cè)方法有效去除光輸出波動(dòng)可能造成數(shù)據(jù)的變動(dòng)，比如由于反應(yīng)體積、細(xì)胞類型、每孔細(xì)胞數(shù)目和/孔間信號(hào)延誤等引起光輸出波動(dòng)。

B2、BRET與FRET相比的優(yōu)勢(shì)

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），生物發(fā)光供體被第二種熒光素所替代，其發(fā)射光譜與受體熒光素的激發(fā)光譜重疊。與FRET相比，BRET的主要優(yōu)勢(shì)在于：沒有光淬滅或供體蛋白的光異構(gòu)化，對(duì)細(xì)胞無光損傷，無光散射，或細(xì)胞或酶標(biāo)板的自發(fā)熒光。因沒有受體直接激發(fā)引起的光發(fā)射，BRET背景更低，允許檢測(cè)更低濃度蛋白間的相互作用。

C、報(bào)告基因檢測(cè)（Rluc as a reporter gene）

海腎熒光素酶（Rluc）用作報(bào)告基因以研究體內(nèi)外的基因調(diào)控和功能，普遍用于多重轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因檢測(cè)或用作熒光蟲熒光素酶轉(zhuǎn)染的內(nèi)參。

工作原理如下：海腎熒光素酶（RLuc），分子量為36kDa的單體蛋白，在氧氣的作用下氧化腔腸素生成熒光（見圖2）。Rluc不需要通過后期的翻譯加工來獲得活性，只需要翻譯后就能用作基因報(bào)告子。

圖2. 海腎熒光素酶（Rluc）催腔腸素發(fā)光的反應(yīng)流程。

我司提供天然腔腸素以及幾種腔腸素衍生物，它們對(duì)鈣離子的親和力，光譜特性，以及應(yīng)用傾向上會(huì)有差異，詳見表1—天然腔腸素及其衍生物的光譜特性，表2—天然腔腸素及其衍生物的應(yīng)用差異選擇適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。

表1 天然腔腸素及其衍生物的光譜特性：

表2天然腔腸素及其衍生物的應(yīng)用差異：

腔腸素系列產(chǎn)品重要事項(xiàng)：

1. 腔腸素凍干粉需-20℃避光保存，且保存在惰性氣體下。

2. 溶于甲醇或乙醇，不可溶于DMSO。

3. 腔腸素儲(chǔ)存液不建議保存在-20℃或-70℃。因腔腸素是一種高能量的雙雜環(huán)丁酮環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即使在低溫下也會(huì)自發(fā)降解。

綜合以上的特征，我司提供所有凍干粉產(chǎn)品都含惰性氣體保證其穩(wěn)定性。且多以小包裝（50μg或500μg）的形式提供，以減少因單次使用不完造成的資源浪費(fèi)。

體內(nèi)注射用腔腸素產(chǎn)品：

我司特別提供專門用于體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究用的注射用腔腸素產(chǎn)品。粉末不僅純度非常高，且提供特別溶劑以增強(qiáng)粉末的溶解能力。

應(yīng)用示例【生物化學(xué)發(fā)光體內(nèi)成像】

Fig. In vivo visualization of mitochondrial Ca2+uptake in the hindlimb muscle after stimulation of the sciatic nerve. (A) Direct visualization of Ca2+-induced bioluminescence in the hindlimb muscle after tetanic stimulation of the sciatic nerve (5 ms pulses at 50 Hz for 2.5 s). Each frame represents 1 s of light accumulation superimposed with the video image taken before the acquisition of bioluminescence. The FOV was 16×12 cm. Smoothing has been applied to the bioluminescent image overlay to a resolution of 1 mm. Color scale is in photons/pixel/s. (B) Mice were injected (i.v) with native coelenterazine (4 mg/kg) and Ca2+-induced light emission was recorded immediately after in the hindlimb muscles in response to tetanic stimulations applied every 2 minutes over more than 1.5 hours. The plot shows the increasing amplitude of the light response (photons/s) as a function of time.

注意事項(xiàng)：

1.      所有產(chǎn)品僅供科研用途，不可用做臨床或診斷用途。

2.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。