鐵錘超級裂菌液

TieChui E.coli Lysis Buffer

產品介紹

1 細胞壁

大腸桿菌是實驗室最常用的革蘭氏陰性菌原核表達體系。革蘭氏陰性菌的細胞壁由內外兩層脂雙層細胞膜夾雜一層肽聚 糖組成。肽聚糖的糖鏈部分由高度重復二糖單元構成（N-乙酰葡萄糖胺和 N-乙酰胞壁酸以 beta-1, 4糖苷鍵連接），肽 聚糖的肽段部分通常是通過丙氨酸的氨基和胞壁酸的羧基形成酰胺鍵，不同肽段的側鏈之間再形成交聯。

2 裂菌方法

常見的大腸桿菌裂解方法有兩大類：

1) 物理方法，例如超聲法、均質法、研磨法、凍融法等。物理方法的優勢在于不 引入雜質成份、成本低、效率高。超聲破碎法是實驗室裂菌（0.5-5 L培養物）的首選；工業級別的大體積高密度發酵菌 體通常使用均質破碎方法，均質破碎法可以 1小時內處理 10 L以上菌體。研磨法和凍融法由于處理通量和效率的限制， 往往只在特定的實驗中使用。

2) 化學方法，例如有機溶劑法、酸堿裂菌法、溶菌酶消化法。化學方法的優勢在于不受 體積的限制，可以處理微升級別樣品。其中，酸堿裂菌法速度快、效率高，但條件劇烈不利于維持蛋白質的天然構象， 此方法在質粒抽提中運用最為廣泛。有機溶劑法也易造成蛋白的失活，僅適合特定應用方向。

3 裂菌液

鐵錘超級裂菌液(TieChui E.coli Lysis Buffer)，適用于大腸桿菌菌體的快速、溫和、低成本裂解，釋放菌體內蛋白。本產 品為單組份，操作簡單、重復性好。含有的溶菌酶可以在 1分鐘內破開細菌細胞壁，將其降解為胞壁二糖；含有的核酸 酶可在 1分鐘內消化細菌的 DNA和 RNA，將其降解為寡聚核苷酸片段。使用本產品可以有效降低細菌裂解后上清粘度， 抑制目的蛋白的降解，提高后續樣品澄清效果，提升樣品上柱純化的效率，減少內毒素污染。

4 溶菌酶

裂菌液組份中含有溶菌酶，是一類水解細菌細胞壁的酶類總稱，可以水解細菌肽聚糖的不同部位，例如 T7噬菌體溶菌 酶是一種酰胺酶（Amidase），可以打開肽聚糖的糖鏈和肽鏈之間的酰胺鍵；雞蛋清溶菌酶可以打開肽聚糖的糖鏈部分 (N-acetyl glucosaminidase)；內肽酶可以切開肽聚糖肽鏈(Endopeptidase)。鐵錘超級裂菌液含有復合溶菌酶，可以在細 菌細胞壁的不同位置高效切開裂口，實現胞內蛋白質的完美釋放。

5 核酸酶

菌體破裂以后，胞內的蛋白質、小分子、DNA、RNA都會釋放到胞外，此時需要將核酸充分打斷，否則帶有強負電性 的核酸將和目的蛋白以及雜質相互作用，導致純化的產物純度降低，并堵塞純化填料、降低柱效以及影響填料的使用壽 命。在超聲和均質破菌方法中，物理的剪切力無差別的打斷肽聚糖、核酸以及蛋白質，為降低樣品粘度，通常要多次超 聲或者均質。過度的物理作用不僅會造成特定的目的蛋白斷裂，純化產物出現降解條帶，也會因為熱量的作用造成蛋白 質的活力喪失。而鐵錘超級裂菌液含有重組超級核酸酶，它可以快速切斷 DNA、RNA，不會影響目的蛋白的一級序列 以及高級結構的完整。因此使用本裂菌液提取蛋白，不會造成目的蛋白的“額外”破壞，是一種溫和、快速、高效的破菌方案。

6 主要用途

1) 小量細菌的快速裂解，后續可接小量誘導蛋白的可溶性鑒定。

2) 中量細菌的快速裂解，后續可接蛋白純化、性質表征。

3) 大量細菌的快速裂解，降低樣品粘度，有利于提高規模制備的效率以及蛋白純度。

使用方法

1 菌體收集

1) 對細菌進行培養，誘導表達目的蛋白。

2) 通過離心、超濾等適當方法，去除發酵液上清，收集菌體，對菌體進行稱重，記錄重量。

2 菌體裂解

1) 按照 1g濕菌體加入 9 mLTris-HCl緩沖液（如 TBS緩沖液：20 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.6）的比例，對菌 體進行重懸，確保分散充分，可采用旋渦震蕩、磁力攪拌等手段。緩沖液不推薦磷酸鹽（PBS），因其會抑制核酸酶活 性，但抑制作用并不明顯，如果使用 PBS緩沖液，請適當延長裂菌時間。

2) 按照菌體重懸液 步驟1）體積的 1/9（V/V，例如：使用了 9 mLTBS緩沖液重懸，就加 1 mL裂菌液）加入鐵錘超級裂菌液，攪拌或振蕩混合均勻。

3) 將步驟 2) 樣品置于 4-25℃條件下（溫度根據蛋白穩定性進行合理選擇），裂解 1-10分鐘，會看到菌體懸液漸 漸變清亮透明。如果目的蛋白可溶，可以選擇快速裂解，約1分鐘即可釋放 80%以上的目的蛋白至上清中；如果目的蛋 白是包涵體，可以選擇更長裂菌時間，盡量充分消化細胞壁，以便獲得純度更高的包涵體。

4) 使用離心（離心力＞8000g）的方法，分離上清與沉淀。如果目的蛋白為可溶蛋白，取上清進行后續純化；如果目的蛋白是包涵體，收集沉淀樣品，對沉淀中的包涵體進行洗滌、變性溶解，再使用適當方法進行純化。

注意事項

1 因裂菌液采用了溶菌酶消化細胞壁的策略進行破壁，會釋放胞壁二糖成份，競爭結合麥芽糖結合蛋白的底物結合位 點，因此本產品與 MBP-tag純化體系不兼容。其它常見的 His-tag、GST-tag、Tactin II-tag、FC-tag、S-tag、proteinA-tag、 CBD-tag等技術體系不受影響。

2 本產品使用了溫和的非離子型去垢劑，不會造成蛋白失活，使用的復合溶菌酶以及超級核酸酶均不帶純化標簽，不會干擾下游純化。

3 實驗室最常用的誘導劑為 IPTG，通常使用終濃度為10μM-1mM，誘導劑濃度對于目的蛋白的溶解性影響并不大，不用在摸索誘導劑濃度上浪費時間，我們推薦使用0.1mM IPTG的誘導濃度。若希望改善可溶比例，優先考慮低溫以及增加促溶標簽。乳糖也可以很好的誘導特定啟動子的表達，最終收獲的菌量會比 IPTG更高。在 LB培養基中，37℃誘導，通常4小時目的蛋白表達量即達到高峰，可以收集菌體。如果使用低溫誘導，誘導時間可適當延長至 6-8小時。過夜誘導對于大部分蛋白的表達并沒有明顯的收益，菌量增加很少但降解條帶增多。

4 實驗室的 LB培養基表達，每升可以收獲菌體約為 3g，如果是發酵罐高密度發酵，每升培養基可以收獲菌體100g。收獲的菌體暫時不用，需要保存在-20℃或-80℃條件，防止降解。

5 對于使用 LB培養基進行搖瓶培養，可以按照每升收獲的菌體加入 27mL TBS緩沖液，低溫震蕩或者超聲清洗槽內 超聲分散完全后加入 3mL鐵錘超級裂菌液，震蕩混勻即可看到菌體懸濁液逐漸澄清。

6 菌體裂解在最優條件下 1分鐘即可以完成，如果緩沖液不合適，比如含有磷酸鹽、含有高鹽、pH偏離中性等，裂 解速度會變慢。如果趕進度，可以去離心，對可溶目的蛋白的釋放影響不大，離心之后，核酸酶與溶菌酶留在上清中， 可以繼續消化。如果不趕進度，可以適當延長裂菌時間。

7 室溫 20-25℃條件下，裂菌液含有的酶活力較高，但通常推薦 4℃低溫裂菌，以控制目的蛋白的降解。

8 離心之后，通常樣品已經得到充分澄清，并不需要再做深層過濾或者膜包過濾；如果樣品不夠澄清，可以考慮增加其它澄清步驟。

9 與上一代飛刀TM裂菌試劑盒相比，鐵錘超級裂菌液把核酸酶與溶菌酶整合到了一個溶液中，屬于 All in one的形態， 使用更加簡潔，無需再添加額外的超級核酸酶。但加入裂菌液之前，菌體要分散充分，這樣更有利于裂菌。

10 鐵錘超級裂菌液不含有螯合劑 EDTA,所以不會造成鎳離子的脫落，但通常考慮到后續放大的重復性，在使用鎳親和填料體系的時候，推薦使用第三代 Ni Smart 親和填料，這一產品高度耐堿清洗，不用每次使用都進行再生。

保存條件

1) 本產品為單組分，短期內（60天）可放置于 2-8℃保存，長期保存可凍存于-20℃或-80℃，避免反復凍融。

2) 產品運輸溫度為 2-8℃；可以在收到產品后，分裝凍存，復溶后需要混合均勻再使用。