Magneti-G RFP 標簽免疫沉淀免疫共沉淀試劑盒

產(chǎn)品介紹 

1 Magneti-G商標 

Magneti-G商標來自于磁性（Magnetic）的英文諧音，G為高聚物的漢語拼音的首字母，因此本公司帶有這一商標的產(chǎn)品，均為高聚物材質(zhì)的磁性微 球。這一商標主要用于一系列基于抗體親和方法的標簽蛋白IP試劑盒，目前已有Anti-His-tag、Anti-Myc-tag、Anti-HA-tag、Anti-DYKDDDDK-tag、 Anti-GFP-tag和Anti-RFP-tag六種標簽IP試劑盒。 

2 RFP標簽 

紅色熒光蛋白基因是從海葵中分離出的一種紅色熒光蛋白基因，其蛋白質(zhì)的最大吸收光譜為583nm，不需要任何預(yù)處理便可檢測到，通過重組DNA 技術(shù)將RFP標簽融合到目的蛋白的C端或N端后，可以檢測其融合表達蛋白的表達、定位純化，該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于各種細胞類型，包括細菌、酵 母和哺乳動物細胞等。 

3 Anti-RFP抗體 

Anti-RFP抗體可以用于檢測和RFP標簽融合表達蛋白的表達、細胞內(nèi)定位，也可以用于RFP融合表達蛋白的純化、定性或定量檢測。本公司的 Anti-RFP親和力較高，適合做WB、IP等蛋白互作實驗。 

4 磁珠性質(zhì) 

高聚物磁珠采用高分子聚合技術(shù)將超順磁性材料和高分子材料完美地結(jié)合在一起，具有更快的磁響應(yīng)性同時保持微球良好的分散性、極低的非特異性 吸附和更豐富的結(jié)合位點。磁珠具體性能見表1。 

表1：Magneti-GAnti-RFPBeads產(chǎn)品性能

5 試劑盒組分 

本產(chǎn)品適用于原核和真核細胞裂解物或者培養(yǎng)上清中分泌表達的RFP標簽蛋白的IP、Co-IP等蛋白質(zhì)相互作用實驗，具體組分見表2。

表2：試劑盒組份

使用方法

1 緩沖液配制

1)  1×Lysis Buffer(A+B)配置：使用前將IP Lysis Buffer A（5×）用ddH₂O稀釋成1×IP Lysis Buffer A，并補加終濃度為0.1%的IP Lysis Buffer B（1ml 1×IP Lysis Buffer A中加1ul IP Lysis Bufer B），標記為1×Lysis Buffer（A+B）備用。稀釋后的緩沖液建議4℃保存； 

2）1×IP Wash Buffer配置：將IP Wash Buffer（10×）用ddH2O稀釋10倍使用。如：配置10ml1×IP Wash Buffer，具體操作為取1ml IP Wash Buffer， 加入9ml ddH₂O，充分混勻標記為1×IP Wash Buffer即可使用。實驗未用完的1×IP Wash Buffer可穩(wěn)定保存在2-8℃3個月，保存時間過久易 長菌。 

3) PBS為自備試劑。

2 樣品前處理 

A 懸浮細胞樣品裂解 

1) 1000×g室溫離心5min，棄上清，收集細胞； 

2) 用適量PBS將細胞團輕輕重懸，將細胞懸液以1000×g離心5min ，棄上清，收集細胞。重復三次； 

3）向細胞團塊中加入預(yù)冷1×Lysis Buffer (A+B)，每1×106-5×106cels使用1000ul。 

4）將上述加了1×Lysis Buffer（A+B）的樣品上下顛倒混勻5-10次，隨后置于冰上裂解5-10min，期間混勻2-3次。 

5）13,000×g 離心10min，去除細胞碎片。 

6）將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，標記為細胞裂解樣品。 

B 貼壁細胞樣品裂解 

1) 小心除去單層細胞的培養(yǎng)基 

2) 用適量預(yù)冷的PBS細胞清洗三次。 

3）根據(jù)表3中推薦體積將1×IP Lysis Buffer（A+B）慢慢滴加至細胞孔板中，滴加時盡量覆蓋整個平皿，隨后置于冰上裂解5-10min，期間混勻 2-3次。 

4）將上述裂解好的樣品轉(zhuǎn)移至新的離心管中，約13,000×g 離心10min，去除細胞碎片。 

5）將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，標記為細胞裂解樣品。 

表3.1×IP Lysis Buffer（A+B）推薦體積

C 注意事項 

真核表達的分泌蛋白可直接取培養(yǎng)上清離心。真核表達的胞內(nèi)蛋白先用1×PBS（pH=7.4）清洗3-5次，隨后用裂解液裂解細胞后離心取上清，再進 行后續(xù)步驟。核酸是強電性物質(zhì)，如果核酸吸附到磁珠上，最終將造成雜蛋白變多。除去核酸有兩個常用的方法： 

1) 充分超聲可以打斷核酸，但過度超聲也7會造成蛋白降解。 

2) 使用伯儀生物超級核酸酶(SLP008)消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分 散脂類團塊，有助于獲得更純的目的蛋白。

3 磁珠漂洗 

1) 將磁珠充分混勻后取20ul磁珠置于離心管中，向管中加入500ul1×IP Wash Buffer，上下顛倒混勻5-10次。 

2) 將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。 

3) 向管中加入500ul1×IP Wash Buffer，上下顛倒混勻5-10次，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，吸棄上清。

4) 重復操作3次。

5) 注：本試劑盒中提供適量陰性對照（Magneti-G Control IgG Beads），免疫沉淀實驗時建議設(shè)置陰性對照組。使用方法與Magneti-G Anti-RFP Beads完全一致。若有更多需求，可以訂購本公司的Magneti-G Control IgG Beads(貨號：MP5801) 

4 樣品孵育

1) 向上述漂洗好的磁珠中加入500-1000ul的細胞裂解樣品，常溫或4℃下孵育60min（建議在旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）。

2) 孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，留樣備檢。

3) 向離心管中加入500ul1×IPWashBuffer，輕輕顛倒混勻5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清。

4) 重復操作5次。

注：孵育溫度和時間范圍推薦為：室溫0.5h-2h或者4℃、1h-4h，根據(jù)實際的結(jié)合效果適當調(diào)整孵育時間，不建議過夜孵育，過夜孵育可能會引起 過多的非特異性吸附。磁珠每次洗滌，加入IP Wash Buffer后可以冰上靜置3-5分鐘。

5 蛋白洗脫 

1) 洗脫液洗脫 每20ul原始磁珠體積加入40ul洗脫液，常溫或4℃洗脫5-10min，期間輕輕混勻3-5次。孵育結(jié)束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸 取上清至新的離心管中，進行Western檢測。 注：Elution Buffer D可以充分洗脫標簽蛋白，且能保證磁珠上的抗體只有很少量的脫落，但是磁珠上可能有少量目的蛋白殘留。 

2) SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫 每20ul原始磁珠體積加入30ul的PBS（自備）重懸磁珠，再加入30ul的2×SDS Loading Buffer，輕搖搖晃混勻后95-100℃高溫處理5-10min。將 離心管置于磁力架上分離10s，取上清進行SDS-PAGE電泳或進行Western檢測。 

注：SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫會使目的蛋白能夠完全從磁珠上脫離，但是抗體也會完全脫落。磁珠上Anti-RFP抗體為人源化抗體，后續(xù)WB實驗建議選擇鼠抗。Western檢測的上樣量建議控制在20ul以內(nèi)，剩余的樣本可凍存于-20℃保存。

注意事項 

1) 本產(chǎn)品保存在2-8℃，不可凍結(jié)保存； 

2) 本產(chǎn)品出現(xiàn)輕微團聚屬正常現(xiàn)象，可正常使用； 

3) 本產(chǎn)品不要使用含有DTT等還原劑的細胞裂解液樣品，DTT可能會導致抗體配體的脫落； 

4) 本產(chǎn)品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會導致抗體配體脫落； 

5) 在清洗和洗脫時避免吸取到磁珠，清洗時吸取到磁珠會影響最終的載量，洗脫時吸取到磁珠會影響目的蛋白的質(zhì)量和電泳效果，第一次洗脫后 可以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進行吸附。

參考信息 

1) RFP tag IP實驗：樣品為胞內(nèi)表達蛋白，含有His和RFP標簽。 

2) 取0.5ml懸浮細胞（≈1.5×106個）常溫下1×PBS（pH=7.4）清洗三次后快速進行裂解、離心；

3) 加入20μl已經(jīng)清洗過的磁珠于離心后的上清中搖晃孵育30min；

4) 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，分離磁珠和液體，用移液器吸走上清，留下磁珠；

5) 用IP Wash bufer清洗5次后加入2×SDS Loading Buffer 99℃ 高溫處理10min后進行WB；

6) 檢測抗體為Anti His-HRP mAb，陰性對照(-)為不帶RFP抗體的磁珠和樣本孵育。

常見問題與解答 

聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區(qū)別？ 

1) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在30-100μm，交聯(lián)時會有一部分配體會進入球孔內(nèi)部，所以偶聯(lián)載量相對較高，適用于蛋白的快速純化；而聚 合物磁珠通常粒徑為1-3μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結(jié)合蛋白，空間位阻影響小，適用于蛋白互作實驗，但 其載量不高； 

2) 推薦使用瓊脂糖磁珠進行蛋白純化實驗，使用聚合物磁珠進行蛋白互作實驗如IP、Co-IP和pull down實驗等。 

為何結(jié)合不到目的蛋白？ 

1)  可能是由于蛋白無表達造成的，建議在純化前用WB檢測下蛋白原始表達量，如果WB無信號，目的蛋白很難捕獲； 

2) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質(zhì)，建議選用合適的裂解液。