rProtein A/G MagPoly Beads

產品介紹

rProtein A/G MagPoly Beads（蛋白 A/G聚合物磁性微球）是 rProtein A/G高密度定向包被到超順磁性聚合物微球表面，該產品具有更高的 抗體結合能力和較低的蛋白非特異吸附率 ，一步純化即可從血清樣品中分離出純度大于 90%的抗體。產品性能見表 1；用戶可根據目標抗 體的種屬來源及亞型選擇微球的類別 ，Protein A ，Protein G和 Protein A/G與不同抗體的親和性比較參見附表。

表1.rProtein A/G MagPoly Beads產品性能

操作步驟

本操作流程主要為免疫沉淀反應，每次反應使用 50μl rProtein A/G MagPoly Beads為例，可根據需要適當的增加或減少磁珠使用量。

1 緩沖液的準備

 所用水和緩沖液在使用之前建議用 0.22μm或 0.45μm濾膜過濾。

裂解緩沖液：50mM Tris-HCl ，0. 15M NaCl ，1% IGEPAL-CA630 ，1mM PMSF ，pH7.4 

平衡/洗雜液：0. 15M NaCl ，20mM Na2HPO4 ，pH7.0 

洗脫液：0. 1M 甘氨酸 ，pH3.0 

中和液：1M Tris-HCl ，pH8.5 

交聯液：0.2M三乙醇胺 ，pH8.2 

交聯劑：DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride） 

終止液：50mM Tris-HCl ，pH7.5

2 樣品準備 

方案 I: 貼壁細胞的裂解 

1) 小心去除單層細胞的培養基。 

2) 用預冷PBS清洗細胞兩次。 

3) 根據表2的推薦體積向細胞中加入預冷裂解緩沖液。冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。 

4) 將上述裂解好的樣品轉移至一個新的離心管中，約13,000 ×g 離心10 min，分離細胞碎片。 

5) 將上清轉移到一個新管中，進行蛋白濃度測定及后續實驗，標記為細胞裂解樣品。

表2.針對各種標準培養皿的裂解緩沖液的推薦使用體積

方案 II：懸浮培養細胞的裂解

1) 將細胞懸液以 1,000×g離心 5 min，收集細胞，棄上清。

2) 用預冷 PBS將細胞團輕輕重懸，將細胞懸液以 1,000×g離心 5 min，收集細胞，棄上清。

3) 向細胞團塊中加入預冷裂解緩沖液。每 50mg細胞團塊使用 500 μl。

4) 將上述裂解好的樣品在冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。13,000×g離心 10 min，去除細胞碎片。

5) 將上清轉移到一個新管中，備蛋白濃度測定及后續實驗，標記為細胞裂解樣品。

3 磁珠準備

1)將 rProtein A/G MagPoly Beads顛倒或漩渦混合均勻。

2)取 50μl rProtein A/G MagPoly Beads加入新的離心管中。放置在磁分離器上 ，待溶液變澄清后 ，用移液器吸棄保護液。

3)將離心管從磁分離器上取下來，加入 200μl平衡液，混勻，放置在磁分離器上 ，收集磁珠，用移液器吸棄保護液。重復洗 2次。

4 抗體吸附

1) 加入抗體溶液（5-25μg抗體總量） ，充分混勻 ，體積不足 500μl時用平衡液補足。

2) 室溫孵育 10min以上（具體時間根據結合效果調整） ，可以振蕩或漩渦混合均勻。

3) 將離心管置于磁分離器上 ，待磁珠全部吸附后 ，吸棄上清液。如需要可留做進一步檢測。

4) 加入500μl洗雜液混合均勻 ，置于磁分離器上 ，待磁珠全部吸附后 ，吸棄上清液。重復洗雜至少 3次。

5 抗體交聯（備選）

1) 如果需要將抗體和目標抗原復合物共同洗脫 ，請忽略本步驟 ，直接進行操作6。

2) 加入 1ml交聯液 ，振蕩懸浮 ，置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。該操作重復兩次。

3) 再加入 1ml含有 20mM DMP（dimetylpimelimidate dihydrochloride）的交聯液 ，此試劑需要現用現配。振蕩懸浮，在室溫下置于翻轉混 合儀或者手工輕輕翻轉離心管 ，促使溶液和磁珠充分接觸 ，約 30min后 ，置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。

4) 使用 1ml終止液懸浮磁珠 ，終止交聯反應 ，在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管 ，促使溶液和磁珠充分接觸 ，約 15min后 ， 置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。

5) 加入 1ml平衡液 ，顛倒混勻 ，置于磁分離器上 ，大約 1min ，待溶液變澄清后 ，吸棄上清液。再重復兩次。

6 抗原結合反應

1) 加入含有抗原的細胞裂解樣品（步驟 2，通常 100-1000μl)，用移液器輕輕吹打使抗原與磁珠-抗體復合物均勻分散。

2) 在室溫下置于翻轉混合儀或者手工輕輕翻轉離心管 10min，使抗原與抗體充分結合，如結合力較弱則可在室溫下反應 1h或者在 4℃下反應 過夜。

3) 上述完成抗原吸附的磁珠-抗體-抗原復合物進行磁性分離 ，收集上清液 ，以備后續檢測。

4) 向離心管中加入 1ml洗雜液 ，用移液器輕輕吹打使磁珠-抗體-抗原復合物均勻分散 ，然后進行磁性分離 ，棄上清液；從磁分離器上取下離心管 ，再重復洗滌兩次。

7 抗原洗脫

方案一 變性洗脫

此方法洗脫的樣品適用于 SDS-PAGE檢測。

1) 從磁分離器上取下離心管 ，向其中加入 25μl 1×SDS-PAGE Loading Buffer混合均勻 ，95℃加熱10min。

2) 置于磁性分離器上 ，進行磁性分離 ，或者離心 ，收集上清液進行SDS-PAGE檢測。

方案二 非變性洗脫

1) 向磁珠-抗體-抗原復合物中加入 300μl洗脫液 ，混合均勻 ，室溫孵育 10min。

2) 置于磁性分離器上 ，進行磁性分離 ，吸取上清為洗脫液至新的離心管中。

3) 重復步驟 1）和 2）兩次 ，收集洗脫液 ，與 2）收集洗脫液混合 ，加入中和液中和至pH7.0-8.0。

*附表. Protein A、 Protein G 和 Protein A/G 對不同抗體的結合能力

++++：結合能力強；++：結合能力中等；—：結合能力弱或沒有結合。