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Magneti-Q Myc 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒

產(chǎn)品介紹
1 Magneti-Q商標(biāo)
Magneti-Q商標(biāo)來自于磁性（Magnetic）的英文諧音，Q為瓊脂糖的漢語拼音的首字母，因此本公司帶有這一商標(biāo)的產(chǎn)品，均為瓊脂糖材質(zhì)的磁性 微球。這一商標(biāo)主要用于一系列基于抗體親和方法的標(biāo)簽蛋白純化試劑盒，目前已有 Anti-His-tag、Anti-Myc-tag、Anti-HA-tag、 Anti-DYKDDDDK-tag四種標(biāo)簽蛋白純化試劑盒。

2 Myc標(biāo)簽
人的 c-Myc基因是 Myc基因家族的重要成員之一，他與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，Myc是一個(gè)比較大的蛋白，人的 Myc蛋白分子量在 50-70 kDa， Myc標(biāo)簽由來源于人 Myc蛋白 E424-L433的十個(gè)氨基酸（EQKLISEEDL）組成，該肽段分子量為 1.2 KDa。利用重組 DNA技術(shù)，它可以連接 在融合蛋白的 N端或者 C端，有利于對目的蛋白進(jìn)行純化和檢測。

3 Anti-Myc抗體
Anti-Myc抗體可以用于檢測和 Myc標(biāo)簽融合表達(dá)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)定位，也可以用于 Myc融合表達(dá)蛋白的純化、定性或定量檢測。本公司的 Anti-Myc親和力非常高，適合做 WB、IP等蛋白互作實(shí)驗(yàn)。

4 磁珠性質(zhì)

Magneti-Q Anti-Myc Beads是將高濃度的 Myc抗體偶聯(lián)至瓊脂糖磁珠上，可直接用于 Myc融合蛋白的純化。

5 試劑盒組分
本產(chǎn)適用于原核和真核細(xì)胞裂解物或者培養(yǎng)上清中分泌表達(dá)的 Myc標(biāo)簽蛋白的純化。也可以用于 IP、Co-IP等蛋白質(zhì)相互作用實(shí)驗(yàn)。

使用方法

1 緩沖液配制
1×PBST配置：將 PBST緩沖液（10×)用 ddH?O稀釋 10倍使用。如：配置 10ml 1×PBST，具體操作為取 1ml PBST緩沖液（10×),加入 9ml ddH?O，充分混勻標(biāo)記為 1×PBST即可使用。實(shí)驗(yàn)未用完的 1×PBST可穩(wěn)定保存在 2-8℃ 3個(gè)月，保存時(shí)間過久易長菌。

2 清洗磁珠
1) 將磁珠充分混勻后取 100 μl磁珠混懸液置于離心管中放磁力架上靜置，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；
2) 加入 500 μl 1×PBST輕輕顛倒混勻 3次；
3) 將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；
4) 重復(fù)上述操作重復(fù) 3次。
注：可根據(jù)樣本量放大磁珠混懸液的體積（如：1ml樣本加入100 μl磁珠混懸液；2ml樣本加入 200μl磁珠混懸液)。

3 樣品前處理
真核表達(dá)的分泌蛋白可直接取培養(yǎng)上清離心。真核或原核表達(dá)的胞內(nèi)蛋白可用裂解液或超聲的方法破碎細(xì)胞后離心取上清，再進(jìn)行后續(xù)步驟。若樣 品中含有核酸雜質(zhì)會吸附在磁珠上，導(dǎo)致雜蛋白變多。除去核酸常用兩個(gè)方法：
1）充分超聲可以打斷核酸，但過度超聲也會造成蛋白降解；
2）使用伯儀生物超級核酸酶消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分散脂類團(tuán) 塊，有助于獲得更純的目的蛋白。

4 樣品孵育
1) 向上述漂洗好的磁珠中加入 1ml樣品，2-8℃或常溫下孵育 30-60min（建議在旋轉(zhuǎn)混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）；
2) 孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，留樣備檢；
3) 向離心管中加入 500 μl 1×PBST，輕輕顛倒混勻 5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清；
4) 重復(fù)上述操作重復(fù) 5次。
注：蛋白純化需要控制溫度，在 2-8℃下孵育有助于防止蛋白降解。操作時(shí)間也至關(guān)重要，有時(shí)候快速進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比加入蛋白酶抑制劑更能保護(hù)目的 蛋白。建議樣品孵育時(shí)間不要超過 60分鐘，磁珠每次洗滌，加入洗雜緩沖液后可以冰上靜置 3-5分鐘，使雜蛋白從磁珠孔隙中充分溶出。

5 蛋白洗脫
1) 每 100μl磁珠混懸液加入 40μl洗脫液，常溫或 4℃洗脫 5-10min，期間輕輕混勻 3-5次；
2) 孵育結(jié)束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的離心管中，重復(fù)洗脫三次。洗脫蛋白需要分管收集，分別電泳確定純 度。

6 洗脫緩沖液的選擇
1) Elution BufferA（pH3.0）可有效打開抗體與標(biāo)簽之間的相互作用，但由于大部分蛋白僅能耐受 pH5.5以上的條件，酸洗脫對保持標(biāo)簽蛋白的活 性有害，如果不確定融合蛋白可以耐受 pH3.0的酸性緩沖液如甘氨酸緩沖液或者檸檬緩沖液，可以進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，不推薦酸性 pH洗 脫，酸洗脫經(jīng)常造成融合蛋白沉淀在填料孔隙中，洗脫后要盡快進(jìn)行中和（試劑盒中配有 Tris中和液）。
2) Elution Buffer B洗脫可以獲得有活力的蛋白,但由于多肽成本較高且在 2-8℃保存時(shí)可能出現(xiàn)降解，試劑盒中不提供 Elution Buffer B，如需 要可單獨(dú)購買 Myc多肽配制。多肽競爭洗脫的效率較低，通常僅有 50%左右蛋白可以洗脫。
3) Elution Buffer C為高鹽競爭洗脫，可以獲得更高洗脫效率，同時(shí)也可以保留標(biāo)簽蛋白的活力，但有些蛋白可能在高鹽條件下沉淀，且高鹽條件 可能抑制蛋白質(zhì)之間相互作用或者干擾酶活，所以洗脫產(chǎn)物要及時(shí)進(jìn)行透析處理，或者使用本公司的脫鹽柱進(jìn)行緩沖液切換。高鹽競爭洗脫效率高、 成本低，可以優(yōu)先考慮。
4) Elution Buffer D含有高濃度尿素以及去垢劑，可以充分洗脫標(biāo)簽蛋白，但大部分蛋白在這個(gè)條件下都會失去活力，僅適合不需要蛋白活力的質(zhì) 譜鑒定、WB等實(shí)驗(yàn)。

注意事項(xiàng)
1) 本產(chǎn)品保存在 2-8℃冰箱中，不可凍結(jié)保存；
2) 本產(chǎn)品出現(xiàn)輕微團(tuán)聚屬正常現(xiàn)象，可正常使用；
3) 本產(chǎn)品不要使用含有 DTT等還原劑的細(xì)胞裂解液樣品，DTT可能會導(dǎo)致抗體配體的脫落；
4) 本產(chǎn)品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會導(dǎo)致抗體配體脫落；
5) 在清洗和洗脫時(shí)避免吸取到磁珠，清洗時(shí)吸取到磁珠會影響最終的載量，洗脫時(shí)吸取到磁珠會影響目的蛋白的質(zhì)量和電泳效果，第一次洗脫后可以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進(jìn)行吸附；
6) 本產(chǎn)品不能夠直接高溫加熱磁珠，高溫加熱磁珠將造成抗體大量脫落，后進(jìn)行電泳條帶較多，影響對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。

參考信息
1 分泌蛋白純化：
1) 取 2ml培養(yǎng)基上清，高速離心去除顆粒沉淀；
2) 加入已經(jīng)漂洗過的 100 μl磁珠懸浮液，混合均勻后放置旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫孵育 1h；
3) 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

4) 用 1×PBST清洗 5次后加入不同的洗脫液，每次洗脫孵育 10 min，重復(fù)洗脫三次；

5) 對洗脫產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，

2 胞內(nèi)蛋白純化：
1) 取 3×10^7細(xì)胞 1ml，加入含有超級核酸酶(1μg/ml)的細(xì)胞裂解液，裂解 10min，離心取上清；
2) 加入已經(jīng)漂洗過的 100 μl磁珠混懸液，混合均勻后放置旋轉(zhuǎn)混勻儀上，室溫孵育 1h；
3) 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；
4) 用 1×PBST清洗 5次后加入不同的洗脫液，每次洗脫孵育 10min，重復(fù)洗脫三次；
5) 對洗脫產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE電泳。

常見問題與解答
1 聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區(qū)別？
1) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在 30-100 μm，交聯(lián)時(shí)很大一部分配體會進(jìn)入球孔內(nèi)部，所以偶聯(lián)載量相對較高，非常適用蛋白的快速純化；而 聚合物磁珠通常粒徑為 1-3 μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結(jié)合蛋白，空間位阻影響小，非常適合于蛋白互作實(shí)驗(yàn)， 但其載量不高；
2) 我們推薦使用瓊脂糖磁珠進(jìn)行蛋白純化實(shí)驗(yàn)；使用聚合物磁珠進(jìn)行蛋白互作實(shí)驗(yàn)如 IP、Co-IP和 pull down實(shí)驗(yàn)等。

2為何純化不到目的蛋白？
1) 可能是由于蛋白表達(dá)量低造成的，建議在純化前用 WB或者 SDS-PAGE檢測下蛋白原始表達(dá)量，如果 WB信號很弱或者無信號，目的蛋白很難純化到；
2) 可能由于洗脫方式不正確造成，建議根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行洗脫，如果多肽競爭洗脫（Elution Buffer B）檢測不到目的蛋白可以嘗試 Elution Buffer C進(jìn)行洗脫；
3) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質(zhì)，建議用合適的裂解液。

3為什么不建議高溫加熱磁珠？
1) 本產(chǎn)品由生物素化抗體與 SA瓊脂糖磁珠偶聯(lián)制備而成，如果直接煮球會造成 Sa、抗體失活脫落，在 SDS-PAGE膠上出現(xiàn)很多條帶，從而影 響目的條帶的判斷；
2) 為了解決煮球的問題，我們推薦 Elution Buffer D緩沖液，這個(gè)緩沖液會導(dǎo)致少量配體的脫落，但不會影響后續(xù)結(jié)果的判斷，適用于考馬斯亮藍(lán) 或者 WB檢測。

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