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MagET? IP/Co-IP Kit

產品介紹
MagET? IP/Co-IP Kit是一款能夠配合自動化核酸提取儀，完成免疫沉淀或免疫共沉淀的試劑盒。該試劑盒已經將磁珠、洗雜液等預先分裝 入 Reagent Strips中，使用前只需去除封口膜，在樣品孔中加入裂解好的樣品，然后放入提取儀，選擇預先設置好的程序，接下來免疫沉淀的 操作將由設備自動完成，大大節省了人工操作時間。
試劑盒包含高性能 rProtein A/G MagPoly Beads，能夠實現快速便捷的磁性分離。另外試劑盒內經過優化的緩沖液，為免疫沉淀實驗提供了 合適的反應條件，增強了免疫沉淀實驗的穩定性。聚合物磁珠的配體是重組蛋白 A/G（約 14kDa），同時擁有蛋白A和蛋白G的 IgG結合結構域，具有更廣的抗體亞型結合范圍。
試劑盒的洗脫方式多樣，既可以用低pH的洗脫液將免疫復合物從蛋白A/G磁珠上洗脫，也可以使用電泳上樣緩沖液以變性條件洗脫免疫復合物，直接進行后續檢測分析。
本產品可廣泛應用于細胞裂解物、細胞分泌上清、血清、腹水等樣品中抗原的免疫沉淀反應，具體組分見表 1、2

表1.MagET? IP/Co-IP Kit產品組分

表2. MagET? Reagent Strips組分

注意事項
1) 在進行免疫沉淀操作之前，請務必認真閱讀此說明書。
2) 如果需要在還原條件下洗脫，向1X電泳上樣緩沖液中加入DTT（終濃度 10-20mM）。
3) 經煮沸后的磁珠易聚集并且失去抗體結合能力，經煮沸的磁珠不應再次使用。
4) 為得到理想的實驗結果，請選擇特異性較強的抗體進行免疫沉淀反應。

5) 對于免疫沉淀實驗，不同類型的抗體和抗原結合的親和性是有區別的，抗體與抗原的結合還會受到影響，因此，若本試劑盒提供的緩沖體系 不能獲得很好的實驗結果，可自行優化緩沖液進行實驗。
6) 實驗設計時，建議加入對照組，以備后續實驗結果分析。
7) 在確定實驗結果前，建議保留各步驟抗原、抗體孵育后的樣品以備驗證。

使用流程
1 樣品準備
方案I:貼壁細胞的裂解
1) 小心去除單層細胞的培養基。
2) 用預冷 PBS清洗細胞兩次。
3) 根據表 3的推薦體積中加入預冷的 1×Lysis/Washing Buffer(Enhanced)。冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。
4) 將上述裂解好的樣品轉移至一個新的離心管中，13000×g離心 10 min，分離細胞碎片。
5) 將上清轉移到一個新管中，進行蛋白濃度測定及后續實驗，標記為細胞裂解樣品。

表3.針對各種標準培養皿的1×Lysis/Washing Buffer(Enhanced)的推薦使用體積

方案II：懸浮培養細胞的裂解
1) 將細胞懸液以 1,000×g離心 5 min，收集細胞，棄上清。
2) 用預冷 PBS將細胞團輕輕重懸，將細胞懸液以 1,000×g離心 5 min，收集細胞，棄上清。
3) 向細胞團塊中加入預冷 1×Lysis/Washing Buffer(Enhanced)。每 50 mg細胞團塊使用 500 μL。
4) 將上述裂解好的樣品在冰上孵育 5 min，期間混勻幾次。13,000×g離心 10 min，去除細胞碎片。
5) 將上清轉移到一個新管中，以備蛋白濃度測定及后續實驗，標記為細胞裂解樣品。

2 免疫沉淀

抗體推薦用量 2.5 μg，用 1×Lysis/Washing Buffer(Enhanced)稀釋至 500 μL備用。

3 自動化免疫沉淀--MagET? Smart 8

1) 取出 MagET? Reagent Strips，顛倒混勻數次使磁珠重懸，使用前小心撕去鋁箔封口膜，防止液體濺出。

2) 在 MagET? Reagent Strips的第 2孔中加入 3.2預處理的 500 μL抗體稀釋液，在第 4孔中加入 3.1預處理后的 500 μL細胞裂解樣品。向 MagET?洗脫管中加入 100 μL Elution Buffe（r酸性洗脫）或 100 μL 1×電泳上樣緩沖液（變性洗脫）。
3) 將 MagET? Reagent Strips和 MagET?洗脫管置于 MagET? Smart 8核酸提取儀底座上，然后將底座放入 MagET? Smart 8核酸提取儀中。
4) 將 MagET? 4孔磁棒套插入 MagET? Smart 8核酸提取儀磁棒套架卡槽內。
5) 選擇表 4或表 5對應的預設程序并運行，自動化程序結束后，取下 MagET? 4孔磁棒套丟棄，取出 MagET?洗脫管。如果是酸性洗脫，立即向 MagET?洗脫管 Elution Buffer中加入 10-20 μL Neutralization Buffer。
6) 如果是變性洗脫，取出 MagET?洗脫管，100℃加熱 10 min后，離心取上清，進行電泳。

 表4. MagET? Smart 8核酸提取儀程序設定（低pH洗脫）

表5. MagET? Smart 8核酸提取儀程序設定（變性洗脫）

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