Magneti-G 外泌體親和純化試劑盒

產(chǎn)品介紹

1 Magneti-G商標(biāo)

Magneti-G商標(biāo)來(lái)自磁性（Magnetic）的英文諧音，G為高聚物的縮寫，因此帶有這一商標(biāo)的產(chǎn)品，均為高聚物材質(zhì)的磁性微球。后續(xù)將根據(jù)客 戶的需求，基于 Magneti-G磁珠開發(fā)更多相關(guān)產(chǎn)品。

2 外泌體功能介紹

外泌體和其他細(xì)胞外囊泡（EVs）屬于細(xì)胞膜囊泡，包含蛋白，mRNA，microRNA，DNA和脂類。外泌體直徑 30-150nm，多種細(xì)胞在正常及病 理狀態(tài)下均可分泌外泌體，其主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中，且外 泌體天然存在于體液中，包括血液、唾液、尿液、腦脊液和乳汁中。外泌體具有多種多樣的功能，其功能取決于其所來(lái)源的細(xì)胞類型，其可參與 到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等。

3 外泌體的形成過(guò)程

膜雙層通過(guò)磷脂的不對(duì)稱分布來(lái)維持脂質(zhì)的“多面性”。外膜富含磷脂酰膽堿和鞘磷脂，而內(nèi)膜主要由磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)和磷脂酰乙醇胺形成。微泡由質(zhì)膜出芽形成，主要原因是由于 Ca2+通過(guò)磷脂雙分子層破壞了膜的不對(duì)稱性，導(dǎo)致磷脂跨膜雙層的重新分配， 促進(jìn)膜起泡，最終導(dǎo)致出芽過(guò)程的進(jìn)行，出芽形成芽泡，將泡體中的外泌體釋放到細(xì)胞外，這樣就形成了一個(gè)完整的外泌體。

4 試劑盒組份

Magneti-G外泌體親和純化試劑盒將外泌體結(jié)合蛋白定向偶聯(lián)至高聚物磁珠上，采用親和純化的方法進(jìn)行外泌體的純化，該方法可以很方便 獲得高純度的外泌體。該試劑盒利用中性 pH的洗脫液，很溫和的將捕獲的 EVs從磁珠上洗脫下來(lái)，可以獲得完整的外泌體，純化的完整外泌 體和其他 EVs可用于不同實(shí)驗(yàn)，包括 WB檢測(cè)，電鏡分析，納米粒子追蹤分析，納米流式等。

5 磁珠性質(zhì)

高聚物磁珠采用高分子聚合技術(shù)將超順磁性材料和高分子材料完美地結(jié)合在一起，具有更快的磁響應(yīng)性同時(shí)保持微球良好的分散性、極低的非特異性吸附和更豐富的結(jié)合位點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸分離提取、細(xì)胞分選、酶的固定等多個(gè)領(lǐng)域。Magneti-G Exosome Affinity Beads是利用共價(jià)修飾的方法將外泌體結(jié)合蛋白偶聯(lián)至高聚物磁珠上，純化方法簡(jiǎn)單、高效便捷。

6 樣本選擇

Magneti-G外泌體親和純化試劑盒適用于多種樣本的外泌體純化，我們測(cè)試過(guò)培養(yǎng)基上清、血清、血漿以及尿液樣本，都有非常好的外泌體純化效果，但植物外泌體沒有進(jìn)行測(cè)試，客戶如有需求可自行檢測(cè)。

使用方法

1 樣品預(yù)處理

取待純化的樣品進(jìn)行差速離心，首先用 300g離心 10min，繼續(xù)收集上清，再用 2000g離心 10min，最后用10000g再離心 10min，將收集的 上清用 0.22μm的濾膜進(jìn)行過(guò)濾處理（可選），如果樣本體積較大可以配套使用本公司外泌體快速純化試劑盒進(jìn)行濃縮，濃縮方法參考外泌體 快速純化試劑盒說(shuō)明書，隨后在上清中加入 5%（V/V）樣品體積的 Exosome-Binding Buffer，上下顛倒混勻。

2 磁珠預(yù)處理

本產(chǎn)品用于外泌體純化制備的實(shí)驗(yàn)，1ml磁珠能夠處理不超過(guò) 50ml體積的樣本，載量≥109 particles/ml，可根據(jù)樣品中外泌體的含量的預(yù) 估加入對(duì)應(yīng)體積的磁珠，也可以直接取 1ml的磁珠與 30-50 ml樣本（不含 Exosome-Binding Buffer體積）與孵育進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，后續(xù)可根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行修正。取出計(jì)算好的磁珠置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去保存緩沖液，用 Exosome-Wash Buffer清洗5次，1ml磁珠加入1ml Exosome-Wash Buffer，注意讓磁珠盡量全部吸附，吸取的時(shí)候盡量不要吸到磁珠，磁珠損失會(huì)影響載量。

3 孵育和洗雜

將處理過(guò)的 Magneti-G Exosome Affinity Beads加至樣品中在4℃搖晃孵育1-2h，隨后將磁珠置于磁力架上靜置，待磁珠完全吸附后吸去 上清，加入一定體積的 Exosome-Wash Buffer輕輕顛倒混勻 3-5次，再將懸液置于磁力架上，同樣待磁珠完全吸附在離心管壁后吸棄上清， 重復(fù)5次，1ml磁珠加入1ml Exosome-Wash Buffer。

4 樣品洗脫

洗脫 Buffer選用Exosome-Elution Buffer，進(jìn)行 3-4次分管洗脫，1ml磁珠加入 0.5ml洗脫液進(jìn)行搖晃洗脫，每次洗脫時(shí)間 5min，搖晃要盡量輕柔，防止外泌體在洗脫過(guò)程中破碎。

5 外泌體保存與應(yīng)用

將收集的外泌體溶液保存于-20℃或-80℃冰箱中，盡量避免反復(fù)凍融，可分裝以備下游檢測(cè)和應(yīng)用。如需無(wú)菌培養(yǎng)，可使用0.22μm無(wú)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾收集。

注意事項(xiàng)

1) 本產(chǎn)品保存在 2-8℃冰箱中，不要凍結(jié)保存；

2) 本產(chǎn)品出現(xiàn)輕微團(tuán)聚屬正常現(xiàn)象，可正常使用；

3) 外泌體較脆弱，建議盡量在低溫下進(jìn)行操作，防止外泌體活性受損，影響下游實(shí)驗(yàn)；

4) 提取的外泌體保存在-20℃或-80℃中，可保存半年時(shí)間，外泌體分裝使用，盡量避免反復(fù)凍融；

5) 樣本中不要含有金屬離子螯合劑。

參考信息

293細(xì)胞外泌體純化：

1) 取30ml培養(yǎng)基上清，差速離心去除顆粒沉淀，加入 5%的 Exosome-Binding Buffer；

2) 加入1ml已經(jīng)清洗過(guò)的磁珠，混合均勻后放置振蕩器上，室溫孵育1h；

3) 將含有磁珠的樣品管轉(zhuǎn)移到磁力架上，分離磁珠和液體，用移液器吸走上清，留下磁珠；

4) 用 Exosome-Wash Buffer清洗 5次后加入 Exosome-Elution Buffer，每次洗脫孵育 5 min，重復(fù)洗脫三次；

5) 對(duì)洗脫產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)志物蛋白的 WB檢測(cè)、納米流式檢測(cè)以及電鏡檢測(cè)，

常見問(wèn)題與解答

1 如何快速鑒定純化后的產(chǎn)物是否含有外泌體？

1) 直接裂解洗脫樣本，通過(guò)吸光值、BCA或者 Bradford檢測(cè)下蛋白濃度，通常外泌體的獲取量和蛋白濃度呈現(xiàn)正相關(guān)；

2) 外泌體檢測(cè)最直接的方式是仍然是 WB檢測(cè)，外泌體的幾個(gè)特征性標(biāo)志物 CD9、CD63、CD81、TSG101和 HSP70等，通常 WB選用 2-3個(gè)特異性蛋白進(jìn)行 WB檢測(cè)可初步判斷樣品中是否含有外泌體。

2 為何洗脫后的樣本中不含有外泌體或含量低于正常值？

1) 可能是樣本中所產(chǎn)生的外泌體較少，適當(dāng)擴(kuò)大預(yù)處理的樣本容量，并排除培養(yǎng)過(guò)程中因活率過(guò)低或其它原因?qū)е碌耐饷隗w污染；

2) 雖然看不見但可以結(jié)合下游實(shí)際需求進(jìn)一步分析，可組合其它的檢測(cè)方法如 WB、納米流式等進(jìn)行輔助驗(yàn)證；

3) 在實(shí)際提取分離過(guò)程中是否嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求進(jìn)行分離純化，排除是否因操作不當(dāng)造成樣本的流失；

4) 根據(jù)所提取樣本的特性而定，提取本試劑盒推薦來(lái)源以外的外泌體時(shí)，并不能夠保證提取效率與從 293細(xì)胞培養(yǎng)基上清中提取效率相當(dāng)， 但仍需盡可能保證 4℃的條件下進(jìn)行，排除外泌體降解的可能以及樣本來(lái)源差異。

3 如何長(zhǎng)時(shí)間保存外泌體洗脫液？

1) 外泌體會(huì)降解不推薦長(zhǎng)時(shí)間保存，如果不得以需要長(zhǎng)期儲(chǔ)存，建議在-20℃或-80℃下保存最長(zhǎng)不超過(guò) 30天，若在 4℃下儲(chǔ)存最長(zhǎng)不超過(guò) 7 天；

2) 注意分裝，避免反復(fù)凍融。

4 外泌體分離方法哪種方式最好？

1) 沒有最好的方法，主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定，本款試劑盒的最大特點(diǎn)就是比傳統(tǒng)的超速離心法更快，且對(duì)設(shè)備的依賴性更低；

2) 有條件的情況下可以嘗試多種方式組合提取。

保存與運(yùn)輸

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸，不可凍結(jié)。

保存：2-8 ℃冷藏保存，不可凍結(jié)。