Magneti-Q DYKDDDDK（FLAG）標簽蛋白純化試劑盒

產品介紹

1 Magneti-Q商標

Magneti-Q商標來自于磁性（Magnetic）的英文諧音，Q為瓊脂糖的漢語拼音的首字母，因此本公司帶有這一商標的產品，均為瓊脂糖材質的磁性 微球。這一商標主要用于一系列基于抗體親和方法的標簽蛋白純化試劑盒，目前已有 Anti-His-tag、Anti-Myc-tag、Anti-HA-tag、 Anti-DYKDDDDK-tag四種標簽蛋白純化試劑盒。

2 DYKDDDDK標簽

DYKDDDDK肽段是融合蛋白表達純化過程中最常用的標簽（tag）之一。它可以連接在融合蛋白的 N端、C端或序列中間，具有極好的親水性，更容易展示在融合蛋白的表面，干擾融合蛋白功能的可能性較小。另外這一標簽具有的優勢是連接在目的蛋白的 N端時，可以被 Enterokinase(EKprotease)從序列 C端賴氨酸的位置切除，而不留下冗余殘基。

3 Anti-DYKDDDDK抗體

DYKDDDDK肽段也經常被稱為 Flag肽段,是蛋白研究領域經典的表位標簽之一，廣泛用于免疫雜交、免疫沉淀、親和純化等方向。本公司目前有 兩株 Anti-DYKDDDDK抗體，均有較高的親和力，能夠同時識別 N端和 C端的 DYKDDDDK標簽，適合做 WB、IP、IHC等免疫相關實驗。

4 磁珠性質

Magneti-QAnti-DYKDDDDK Beads是將高濃度的 DYKDDDDK抗體偶聯至瓊脂糖磁珠上，可直接用于DYKDDDDK融合蛋白的純化。

5 試劑盒組分

本產適用于原核和真核細胞裂解物或者培養上清中分泌表達的 DYKDDDDK標簽蛋白的純化。也可以用于 IP、Co-IP等蛋白質相互作用實驗，

使用方法

1 緩沖液配制

1×PBST配置：將 PBST緩沖液（10×)用 ddH?O稀釋 10倍使用。如：配置 10ml1×PBST，具體操作為取 1ml PBST緩沖液（10×),加入 9ml ddH?O，充分混勻標記為 1×PBST即可使用。實驗未用完的 1×PBST可穩定保存在 2-8℃ 3個月，保存時間過久易長菌。

2 清洗磁珠

1) 將磁珠充分混勻后取 100 μl磁珠混懸液置于離心管中放磁力架上靜置，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

2) 加入 500 μl 1×PBST輕輕顛倒混勻 3次；

3) 將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

4) 重復上述操作重復 3次。

注：可根據樣本量放大磁珠混懸液的體積（如:1ml樣本加入 100 μl磁珠混懸液；2ml樣本加入 200μl磁珠混懸液）。

3 樣品前處理

真核表達的分泌蛋白可直接取培養上清離心。真核或原核表達的胞內蛋白可用裂解液或超聲的方法破碎細胞后離心取上清，再進行后續步驟。若樣 品中含有核酸雜質會吸附在磁珠上，導致雜蛋白變多。除去核酸常用兩個方法：

1) 充分超聲可以打斷核酸，但過度超聲也會造成蛋白降解；

2) 使用伯儀生物超級核酸酶消化，這一方法需要注意緩沖液的選擇。低濃度非離子型表面活性劑，如吐溫-20、曲拉通-100可以幫助分散脂類團 塊，有助于獲得更純的目的蛋白。

4 樣品孵育

1) 向上述漂洗好的磁珠中加入 1ml樣品，2-8℃或常溫下孵育 30-60min（建議在旋轉混勻儀上孵育，使樣品和磁珠充分接觸）；

2) 孵育結束后，將離心管置于磁力架上，待磁珠全部吸附后，將上清轉移至新的離心管中，留樣備檢；

3) 向離心管中加入 500 μl 1×PBST，輕輕顛倒混勻 5-10次后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后棄去上清；

4) 重復上述操作重復5次。

注：蛋白純化需要控制溫度，在 2-8℃下孵育有助于防止蛋白降解。操作時間也至關重要，有時候快速進行實驗比加入蛋白酶抑制劑更能保護目的 蛋白。建議樣品孵育時間不要超過 60分鐘，磁珠每次洗滌，加入洗雜緩沖液后可以冰上靜置 3-5分鐘，使雜蛋白從磁珠孔隙中充分溶出。

5 蛋白洗脫

1) 每 100μl磁珠混懸液加入 40μl洗脫液，常溫或 4℃洗脫 5-10min，期間輕輕混勻3-5次；

2) 孵育結束后將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸取上清至新的離心管中，重復洗脫三次。洗脫蛋白需要分管收集，分別電泳確定純度。

6 洗脫緩沖液的選擇

1) Elution BufferA（pH3.0）可有效打開抗體與標簽之間的相互作用，但由于大部分蛋白僅能耐受 pH5.5以上的條件，酸洗脫對保持標簽蛋白的活 性有害，如果不確定融合蛋白可以耐受 pH3.0的酸性緩沖液如甘氨酸緩沖液或者檸檬緩沖液，可以進行預實驗。根據我們的經驗，不推薦酸性 pH洗 脫，酸洗脫經常造成融合蛋白沉淀在填料孔隙中，洗脫后要盡快進行中和（試劑盒中配有 Tris中和液）。

2) Elution Buffer B洗脫可以獲得有活力的蛋白,但由于多肽成本較高且在 2-8℃保存時可能出現降解，試劑盒中不提供 Elution Buffer B，如需 要可單獨購買 DYKDDDDK多肽配制。多肽競爭洗脫的效率較低，通常僅有 50%左右蛋白可以洗脫。

3) Elution Buffer C為高鹽競爭洗脫，可以獲得更高洗脫效率，同時也可以保留標簽蛋白的活力，但有些蛋白可能在高鹽條件下沉淀，且高鹽條件 可能抑制蛋白質之間相互作用或者干擾酶活，所以洗脫產物要及時進行透析處理，或者使用本公司的脫鹽柱進行緩沖液切換。高鹽競爭洗脫效率高、 成本低，可以優先考慮。

4) Elution Buffer D含有高濃度尿素以及去垢劑，可以充分洗脫標簽蛋白，但大部分蛋白在這個條件下都會失去活力，僅適合不需要蛋白活力的質譜鑒定、WB等實驗。

注意事項

1) 本產品保存在 2-8℃冰箱中，不可凍結保存；

2) 本產品出現輕微團聚屬正常現象，可正常使用；

3) 本產品不要使用含有 DTT等還原劑的細胞裂解液樣品，DTT可能會導致抗體配體的脫落；

4) 本產品能耐受≤2M尿素，高濃度的尿素會導致抗體配體脫落；

5) 在清洗和洗脫時避免吸取到磁珠，清洗時吸取到磁珠會影響最終的載量，洗脫時吸取到磁珠會影響目的蛋白的質量和電泳效果，第一次洗脫后可 以將洗脫液置于新的離心管中，再次置于磁力架上進行吸附；

6) 本產品不能夠直接高溫加熱磁珠，高溫加熱磁珠將造成抗體大量脫落，后進行電泳條帶較多，影響對實驗結果的判斷。

參考信息

1 分泌蛋白純化：

1) 取 2ml培養基上清，高速離心去除顆粒沉淀；

2) 加入已經漂洗過的 100 μl磁珠懸浮液，混合均勻后放置旋轉混勻儀上，室溫孵育 1 h；

3) 將含有磁珠的樣品管轉移到磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

4) 用 1×PBST清洗 5次后加入不同的洗脫液，每次洗脫孵育 10 min，重復洗脫三次；

5) 對洗脫產物進行 SDS-PAGE電泳，

2 胞內蛋白純化：

1) 取3×10^7細胞 1ml，加入含有超級核酸酶(1μg/ml)的細胞裂解液，裂解 10min，離心取上清；

2) 加入已經漂洗過的 100 μl磁珠混懸液，混合均勻后放置旋轉混勻儀上，室溫孵育 1 h；

3) 將含有磁珠的樣品管轉移到磁力架上，待磁珠完全吸附后，吸棄上清；

4) 用 1×PBST清洗 5次后加入不同的洗脫液，每次洗脫孵育 10 min，重復洗脫三次；

5) 對洗脫產物進行 SDS-PAGE電泳，

常見問題與解答

1 聚合物磁珠和瓊脂糖磁珠有何區別？

1) 瓊脂糖磁珠是帶孔微球，粒徑在 30-100μm，交聯時很大一部分配體會進入球孔內部，所以偶聯載量相對較高，非常適用蛋白的快速純化；而 聚合物磁珠通常粒徑為1-3 μm以下，配體主要分布在微球表面，這種類型的磁珠能夠快速結合蛋白，空間位阻影響小，非常適合于蛋白互作實驗， 但其載量不高；

2) 我們推薦使用瓊脂糖磁珠進行蛋白純化實驗；使用聚合物磁珠進行蛋白互作實驗如 IP、Co-IP和 pull down實驗等。

2 為何純化不到目的蛋白？

1) 可能是由于蛋白表達量低造成的，建議在純化前用 WB或者 SDS-PAGE檢測下蛋白原始表達量，如果WB信號很弱或者無信號，目的蛋白很 難純化到；

2) 可能由于洗脫方式不正確造成，建議根據自己的實驗目的進行洗脫，如果多肽競爭洗脫（Elution Buffer B）檢測不到目的蛋白可以 嘗試 Elution Buffer C進行洗脫；

3) 樣本中有高濃度的還原劑等干擾物質，建議用合適的裂解液。

3為什么不建議高溫加熱磁珠？

1) 本產品由生物素化抗體與 SA瓊脂糖磁珠偶聯制備而成，如果直接煮球會造成 Sa、抗體失活脫落，在 SDS-PAGE膠上出現很多條帶，從而影 響目的條帶的判斷；

2) 為了解決煮球的問題，我們推薦 Elution Buffer D緩沖液，這個緩沖液會導致少量配體的脫落，但不會影響后續結果的判斷，適用于考馬斯亮藍 或者 WB檢測。