膽固醇熒光探針

Filipin III (Cholesterol fluorescent probe) 

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

菲律賓菌素 III（Filipin III）是一種五烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素，是分離自菲律賓鏈霉菌（S. filipinensis）培養(yǎng)物的四種多烯大環(huán)內(nèi)酯異構(gòu)體中的占比最多的一種。歸因其發(fā)熒光且特異性結(jié)合膽固醇的特性，菲律賓菌素 III常常通過(guò)冷凍斷裂電鏡術(shù)和結(jié)合后降低的熒光來(lái)檢測(cè)膜上的膽固醇。菲律賓菌素 III用在番茄細(xì)胞中，觀察激活配體非依賴(lài)性的信號(hào)反應(yīng)。通過(guò)菲律賓菌素 III和膽固醇的螯合活性，破壞正常和轉(zhuǎn)染角質(zhì)細(xì)胞的脂筏，抑制AKT信號(hào)通絡(luò)。菲律賓菌素 III復(fù)合物最大激發(fā)波長(zhǎng)是338和357nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)是480nm。

產(chǎn)品特征：

1）CAS NO.：480-49-9

2）化學(xué)名：4S,6S,8S,10R,12R,14R,16S,27S-octahydroxy-3R-(1R-hydroxy-hexyl)17,28R-dimethyl- oxacyclooctacosa-17E,19E,21E,21E,23E,25E-pentaen-2-one

3） 同義名：16,20,22,24-Octacosapentenoic acid; 16,20,22,24-Octacosapentenoic acid; 3,5,7,9,11,13,15,26,27- nonahydroxy-2-(1-hydroxyhexyl)-16-methyl-, 27-lactone; NSC3364; NSC-3364;

4）分子式：C35H58O11

5）分子量：654.8

6）純度：≥90%

7）外觀：固體

8）溶解性：溶于DMSO（10mg/ml）、DMF（5mg/ml）、乙醇（1mg/ml）、DMSO:PBS(pH 7.2)(1:4)（0.2mg/ml）

9）化學(xué)結(jié)構(gòu)圖：

保存條件: 

-20℃避光干燥保存，至少2年有效。

產(chǎn)品使用：

以下是針對(duì)細(xì)胞樣本的染色方法，僅作參考。用戶需根據(jù)實(shí)際染色樣本和染色條件來(lái)優(yōu)化。

1、 儲(chǔ)存液的制備

將低溫保存的固體平衡至室溫至少20min，低速離心后，于無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)加入適量有機(jī)溶劑（比如：無(wú)水高質(zhì)量DMSO）配置成10mg/ml（=15.2718mM）的儲(chǔ)存液。

2、工作液的制備

于正式實(shí)驗(yàn)前，用PBS、HBSS或其他生理緩沖液稀釋儲(chǔ)存液，到所需的工作濃度，比如：10-100μg/ml。最佳的工作濃度請(qǐng)參閱文獻(xiàn)或自行設(shè)置梯度濃度進(jìn)行摸索。工作液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、 染色步驟（室溫進(jìn)行）

應(yīng)用示例（來(lái)自文獻(xiàn)，僅做參考）

1） 用Filipin III進(jìn)行染色，驗(yàn)證U18666A誘導(dǎo)吞噬體樣囊泡中的膽固醇積累。CU428和II8G-IA細(xì)胞用2μM U18666A或溶劑對(duì)照處理15min，之后加入26 μM膽固醇。1h后，樣本轉(zhuǎn)移到離心管，清洗后重懸于100μl Tris-HCl，加入等體積4%多聚甲醛-3.4%蔗糖室溫固定15min。用PBS清洗后，重懸于100μl PBS中，加入50μg/ml Filipin III（儲(chǔ)存液溶于DMSO，濃度是5mg/ml，充入氮?dú)夂螅?80℃凍存）室溫孵育1h，保持震蕩，最后細(xì)胞清洗2次后，重懸于40μl PBS，滴加到載玻片上進(jìn)行觀察和成像分析。用UV-2A 濾波器組合觀察，用Fiji軟件進(jìn)行成像處理和數(shù)據(jù)分析。

(圖1) Fluorescent microscopy. CU428 and II8G-IA cells were pretreated with 2 μM U18666A or vehicle for 15 min prior to the addition of 26 μM cholesterol. Untreated cells are designated as Control. After 1 h, cells were fixed, stained with Filipin and examined by fluorescence microscopy. Arrows indicate large, phagosome-like vesicles and arrowheads indicate selected small vesicles that were also observed in some cells. To improve visualization, some of the background fluorescence of CU428 cells was allowed, although II8G-IA cells required more contrast stretching as fluorescence levels were identical between treatments. Scale bar?=?50 μm. Results shown are representative experiment repeated three times with similar results.

2）用Filipin III進(jìn)行染色，驗(yàn)證MβCD處理后細(xì)胞膜膽固醇水平的降低。Vero細(xì)胞鋪板在96孔板，用不同濃度的MβCD（2.5, 5, 7.5和10 mM）誘導(dǎo)處理45 min。用冰PBS清洗3次，細(xì)胞用4%多聚甲醛固定。之后，細(xì)胞膜膽固醇用稀釋于PBS的50μg/ml Filipin III（儲(chǔ)存液溶于DMSO，濃度是25mg/ml）孵育2h。高容量成像系統(tǒng)基于Filipin III的熒光強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞膜膽固醇水平。

(圖2) Vero cells were plated in 96-well plates and treated with various concentrations of MβCD (2.5, 5, 7.5, and 10 mM) for 45 min. Cell membrane cholesterol was labeled with 50 μg/mL filipin III, and images were acquired with the Operetta CLSTM High-Content Analysis System.

注意事項(xiàng)：

1.      為了讓化合物更好的溶解，可通過(guò)37℃加熱或（和）超聲波水浴中震動(dòng)片刻來(lái)處理。若實(shí)驗(yàn)所需濃度過(guò)大甚至達(dá)產(chǎn)品溶解極限，請(qǐng)?zhí)砑又軇┲芑蜃孕姓{(diào)整濃度。

2.      菲律賓菌素 III與膽固醇的相互作用會(huì)改變吸收和熒光光譜，為此，在做熒光顯微鏡成像分析時(shí)，使用340-380nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，385-470nm作為發(fā)射波長(zhǎng)。

3.      菲律賓菌素 III的熒光染色漂白非常迅速，因此，染色后樣本務(wù)必盡快分析。

4.      菲律賓菌素 III溶液對(duì)光和空氣都非常敏感。條件允許的話，配置好的溶液分裝凍存，且充入惰性氣體，-80℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

5.      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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